广陈皮“活性指纹图谱”的设想与构思

罗健东¹ 李悦山¹ 郑国栋¹ 蒋林^2*

(1. 广州医学院基础学院 广东 广州510182；2.中山大学药学院广东 广州 510006)

广陈皮是我国岭南著名的中药材，传统用药经验已经表明广陈皮较其它陈皮有更高的药用价值，然而这一结论缺乏现代科学研究证实。《中国药典》（2005版）是以橙皮苷作为陈皮及广陈皮质量控制的指标性成分。资料及我们的研究结果均表明，广陈皮中橙皮苷的含量往往低于其它陈皮，故若单纯以橙皮苷为指标来控制广陈皮的质量，无法反映广陈皮道地性的特色。

中药化学指纹图谱是中药质量控制研究的常用手段，然而由于其“模糊性”的特点，比如存在化学成分不明及与药理作用不相关等问题，也无法从物质基础方面真正阐明广陈皮道地性的特色。

大量研究结果表明，除挥发油外，黄酮类成分是广陈皮及其它陈皮的主要活性成分，也是芸香科柑橘属植物的特征性成分，其所含的多甲氧基黄酮类成分还可作为柑橘属植物分类的指标性成分。研究结果亦表明，陈皮中所含黄酮类成分有着丰富的药理活性，如抗癌、抗氧化、抗诱变、抗炎、抗病毒、抗菌及心血管保护等。在研究中，我们选用5个主要活性黄酮为指标，建立了含量测定方法对不同产地及不同品种品系陈皮药材进行了很好的区分。

鉴于此，我们提出了广陈皮“活性指纹图谱”的科学概念，相较之常规化学指纹图谱，它是针对有效部位建立，有效成分明确，并与化学成分及药理作用相关联的一种指纹图谱，可通过指纹图谱比较广陈皮与其它陈皮在具体有效成分“数”与“量”上的差异，全面、形象地揭示广陈皮道地性特色的物质基础。

1.“活性指纹图谱”的科学概念

所谓的“活性指纹图谱”是指与药理活性及化学成分相关联的指纹图谱。它建立在有效部位且有效成分明确的基础上，以有代表性的指标（有效）成分来反映药材（或原料、提取物、制剂）特征性的指纹图谱。它有以下特点：

（1）有效成分明确

相较之常规化学指纹图谱以未知的特征峰来反映药材的特征，“活性指纹图谱”各特征峰是建立在有效成分得到充分解析的基础上的，有效成分具体、明确。

（2）指纹图谱的特征峰有充分的代表性，能反映药材的特征，其特征峰并不是越多越好

常规指纹图谱往往追求特征峰（成分）的全面性，而忽视了成分的代表性，从理论上来说，许多无效成分也作为特征峰处理；“活性指纹图谱”追求成分的代表性，其针对有效成分建立，以有效成分的差异来反映药材的特征，特征峰并不是越多越好。

（3）各特征峰得到良好的分离，并且特征峰得到充分的解析

常规指纹图谱往往追求特征峰的全面性，因此各特征峰难以得到良好的分离，亦难以得到良好的解析；活性指纹图谱”追求成分的代表性，因此各特征峰更易实现分离和解析。

（4）从指标（有效）成分的“数”与“量”上体现了与药理活性及化学成分的相关性

由于“活性指纹图谱”针对有效部位建立，各特征峰得到了良好的分离及解析，并且通过建立药理活性评价体系对有效部位及有效成分的有效性进行了全面的评价，因此，它是一种与药理活性及化学成分相关联的指纹图谱，从有效成分的“数”与“量”上可直观的反映药材的特征。

2.广陈皮“活性指纹图谱”构建内容与方法

2.1 研究目标与内容

在建立药理活性评价及肠吸收模拟体系基础上，对广陈皮黄酮类有效部位及有效成分开展相关药理活性及可吸收性评价试验。另外，通过标准品对照及结合LC-MS、LC-PDA、LC-NMR等联用技术开展广陈皮有效部位的分析测定，有针对性的建立与化学成分及药理作用相关联的广陈皮“活性指纹图谱”，通过与其它陈皮的化学指纹图谱相对比，从而在化学成分的“数”与“量”上反映广陈皮道地性的特色。以此作为广陈皮质量控制的重要依据，为广陈皮质量标准化奠定基础。

研究的主要内容有：

（1）药理活性评价体系的建立

建立并完善现代药理活性评价体系，并对广陈皮黄酮类有效部位及成分作出科学评价。鉴于广陈皮药材特性，可着重从抗肿瘤及抗氧化两方面加以评价及验证。

（2）肠吸收模拟体系的建立

有效成分一方面既要满足有药理活性，又要满足为人体吸收。可通过建立Caco-2 细胞模型对分离得到的有效部位及单体成分的人体可吸收性进行验证，可结合标准品对照及LC-MS，LC-PDA，LC-NMR等联用技术进行相关分析，以进一步明确有效成分。

（3）广陈皮“活性指纹图谱”的建立及对比

采用适当液相条件，针对广陈皮黄酮类成分有效部位，建立化学指纹图谱。根据标准品对照及结合LC-MS、LC-PDA、LC-NMR等联用技术，通过分析化合物质谱裂解规律及紫外吸收特性共同确定各共有峰结构，结合LC-NMR 分析技术最终确认结构，并与药理活性相联系，建立与化学成分及药理作用相关联的广陈皮“活性指纹图谱”，并与其它陈皮的化学指纹图谱相对比，从化学层面突出广陈皮道地性特色的物质基础。

2.2 研究方案与技术

在肠吸收模拟体系方面，小肠是吸收的主要场所。Caco-2 细胞模型（human colon adenocarcinoma cell lines）是建立在以药物为人体吸收是保证其有效性前提的理论基础上，近几年来发展起来用于药物肠吸收研究的体外模型。为体外培养的肠上皮细胞层（单层），可在体外研究药物的摄取、代谢、排放和穿细胞转运等过程的细节，是探索药物吸收机理的有效手段，也是新药初筛的有效工具。

在化合物的分析鉴定方面，LC-MS是一种理想的快速分析手段。它利用了色谱的高分离能力，而且发挥了质谱的定性专长，通过获得质谱裂解过程的信息，进行有机化合物的结构解析，对混合物的分析有着很高的灵敏度和广泛的适应性。随着离子阱质谱中多级串联质谱技术（MSn）及LC-PDA等技术的广泛应用，为化合物的结构解析提供了更多的信息，可以对混合物直接进行分析，从而得到混合物中各组分的相关结构信息。LC-NMR 是天然产物成分研究中的一种新型分析工具，其中HPLC 提供强有力的分离手段，NMR提供化合物结构的大量信息。在天然产物的分析中，可不用对组分进行分离提取便能确定其结构甚至立体构型。

具体研究方案如图1。

图1  广陈皮“活性指纹图谱”构建方案

Fig. 1  Construction program on “activity fingerprint” of Guang Chenpi

3．拟解决关键问题及可行性分析

（1）药理活性评价体系的构建

广陈皮为传统著名药食同源药材。目前，市面上开发了大量的相关产品，如陈皮饼、陈皮梅、陈皮酒及陈皮饮料等功能性食品。从传统中医用药经验来看，陈皮很少单用，多与其它药物配伍使用，以君、臣、佐、使分类，它列入佐类，性温；从现代医学角度来看，其具有理气健脾等传统中医功效亦更多的是体现在功能性（保健）方面，难以建立中医证候模型评价其传统功效。即使建立模型，药材及化学成分的活性亦难以单独得到体现。传统的中医理论对陈皮其它功效有诸多的论述，如《日华子本草》记载陈皮具有消痰止渴，破癥瘕痃痹的功效；《中国医药大词典》中陈述了陈皮具有破癥瘕痃痹，治疗风痰麻木的功效，而癥瘕痃痹则泛指腹腔内的肿物。另外，从陈皮化痰止咳的传统功效来看，咳嗽多伴有炎症的发生，而炎症的发病机制与抗氧化性密切相关。

因此，本项目拟以最能体现广陈皮活性的抗肿瘤及抗氧化两方面为主建立现代药理活性评价体系，既体现传统，又符合实际。

（2）黄酮类成分有效部位的制备

有效部位难以获得往往是指纹图谱建立的难点。黄酮类成分的中药质量分析中，常用的提取溶剂有乙酸乙酯、乙醇、甲醇等。另外，考虑到多甲氧基黄酮类成分的特殊性（其上羟基常为甲氧基取代，极性较小），实验中比较了石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇四种不同溶剂对广陈皮黄酮类成分的提取效果。结果表明，石油醚是一种富集多甲氧基黄酮类成分的良好溶剂，但提取率低，且其对橙皮苷的提取率几乎为零；乙酸乙酯对多甲氧基黄酮有较高的提取率，对橙皮苷的提取率则较低，且二者均小于乙醇及甲醇；乙醇和甲醇均是提取橙皮苷及多甲氧基黄酮类成分的良好溶剂，但甲醇对橙皮苷的提取率略大于乙醇。

因此，简单采用甲醇作为提取溶剂，超声提取药材既可实现黄酮类成分有效部位的制备。

（3）“活性指纹图谱”的解析

广陈皮活“性指纹图谱”的解析也是本项目研究工作的主要难点之一。“活性指纹图谱”的解析，一方面要建立在特征峰良好分离的基础上；另一方面，要对特征峰予以充分的鉴别。

针对制备得到的广陈皮黄酮类成分有效部位，我们对其液相分离条件进行了摸索，并成功的建立了5种活性黄酮的定量分析方法。除黄酮苷类成分外，各特征峰得到了良好的分离，且该液相条件并不含缓冲盐（见图2），可作为LC-MS流动相选择的参考依据。另外，我们在实验中发现，采用乙腈-水系统可较易实现多甲氧基黄酮类成分的良好分离，但对黄酮苷类成分则较难实现基线分离；采用甲醇-水系统可较易实现黄酮苷类成分的良好分离，对多甲氧基黄酮类成分的良好分离则较难实现，因此，可进一步结合两类溶剂系统的优点，采用乙腈-甲醇-水溶剂系统结合梯度洗脱以实现有效部位中黄酮类成分的良好分离。

“活性指纹图谱”应结合黄酮类成分光谱的特性，黄酮类成分往往具有强烈的紫外吸收，应采用LC-MS、LC-PDA、LC-NMR等联用技术予以结构解析；同时，结合HSCCC技术制备标准品，可有效避免标准品制备过程中的丢失。通过LC-MS或LC-MSn体现黄酮类成分的裂解规律、通过标准品的对照、通过LC-NMR进行结构验证及参考文献资料，能确保“活性指纹图谱”各特征峰结构得到良好解析。我们通过标准品对照及参考文献资料^[1-3]，完成了对已建立液相指纹图谱的初步解析，解析结果见图2及表1，鉴于该液相条件对黄酮苷类成分的分离并非最佳，尚需进一步优化处理。

从指纹图谱情况及解析结果来看，采用甲醇作提取溶剂对广陈皮黄酮类化合物有高度的选择性，该液相指纹图谱基本涵盖了广陈皮黄酮类化合物的全貌，具有高度的代表性；除黄酮苷类成分外，各特征峰得到了良好的分离和解析。通过对色谱条件的继续优化，再结合黄酮类化合物特性辅以LC-MS、LC-PDA、LC-NMR等联用技术，应可以实现对指纹图谱良好的解析。

 

          图2  标准品（a）及广陈皮药材（b）HPLC分析色谱图

（1～5代表黄酮指标化合物1～5）

Fig. 2  Representative HPLC chromatograms of standards mixture (a) and sample (b). (The numbers indicate bioactive flavonoids 1～5)

表 1  广陈皮液相指纹图谱中的黄酮类化合物

Tab. 1  Flavonoids found in HPLC fingerprint of Guang Chenpi

4．讨论与小结

本研究拟通过建立广陈皮“活性指纹图谱”，克服常规化学指纹图谱存在化学成分不明及与药理作用不相关等问题，从而全面揭示广陈皮道地性特色的物质基础。项目拟采用HSCCC结合LC-MS、LC-PDA、LC-NMR等中药化学、药物分析、药理学等学科的多项技术进行分离鉴定及分析测定，通过建立药理模型，从药理活性及可吸收性两方面综合评价化学成分的有效性，最终通过建立广陈皮“活性指纹图谱”，并与其它陈皮相对比，凸显其独具特色的物质基础。

广陈皮“活性指纹图谱”的建立不是一蹴而就的，它涵盖了中药化学、药物分析、药理学等多项学科的多项技术，尤其是在有效性评价方面，需要建立适当现代药理模型甚至结合药代动力学知识予以全方位的评价。正如任何方法都存在缺点，“活性指纹图谱”也有一定的局限性，比如它是建立在有效部位获得的基础上的，通过选择舍弃了许多未知成分，甚至有可能是活性较强的成分，因此，也存在一定的片面性；另外，从建立的过程来看，它是一个体系，较之常规指纹图谱涵盖学科多、工作量大。

本研究的开展将为广陈皮药材的质量标准建立和保护提供科学依据，有利于排除伪品，从而规范市场管理，促进广陈皮产业化的健康发展，为我国传统用药经验与现代科学研究相结合进行研究提供了一条新思路。

参考文献

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